背景：

科学研究表明，人体中存在的蛋白质超过50%是以糖蛋白的形式存在。蛋白质糖基化作为生物体内最重要的蛋白质翻译后修饰形式之一，具有重要的生物学功能，不仅影响蛋白质的空间构象、生物活性、运输及定位等，而且还参与分子识别、细胞通信、细胞分化、信号转导、免疫应答等等在内的各种重要生命活动。在多种疾病，如肿瘤（FDA已批准的用于癌症疾病诊断和监控的生物标志物中大部分是糖蛋白）、神经退行性疾病、心血管病、代谢性疾病、免疫性疾病及感染性疾病的发生发展中均伴随着蛋白质糖基化程度及糖链结构异常的发生。此外，糖基化还显著影响生物治疗剂的生物活性、靶标、运输、血清半衰期、清除率及受体识别等性质。例如，重组促红细胞生成素的药代动力学和效力受其糖基化状态的严重影响，而单克隆抗体通过ADCC介导功效的能力受Fc区岩藻糖含量的影响，因此蛋白质糖基化研究是继核酸、蛋白质之后生命科学中又一极具潜力的研究领域，具有重要理论及应用意义。FDA要求所有类型的糖蛋白都需要进行糖型分析。

肽N-糖苷酶F（PNGase F，EC 3.5.1.52）是从糖蛋白中特异性除去N-连聚糖的糖苷内切酶，是一类重要的糖基化研究的工具酶，被广泛用于治疗性蛋白质上N-连糖链位点、结构信息及功能关系的研究。Rhinogen^® PNGase F（Glycerol-free）是表达于大肠杆菌 BL21中的重组PNGase F，能够将绝大多数N-糖链（除含α-1,3连接的核心岩藻糖，常见于植物及昆虫糖蛋白）完整地从其所连接的蛋白分子上释放下来，可以在 N-连糖肽或糖蛋白的高甘露糖、杂合和复杂寡糖部分最内侧的 N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨残基（Asn）之间进行切割，释放出完整的寡糖链，如图1A。在释放糖链的同时将氨基酸特征序列上的天冬酰胺残基转化为天冬氨酸残基，其赋予蛋白质+ 1Da质量变化，如图1B。它对多种底物具有高度活性，包括纯化的糖蛋白和人血清糖蛋白的复合混合物。此外，由于不含甘油，在非变性条件下，酶与HPLC及质谱工作流程环境兼容。连接到N-连寡糖的磷酸盐，硫酸盐和唾液酸基团不影响N-糖链的释放。

图1A. PNGase F特异性切割位点；

图1B. PNGase F释放糖链的反应机制

产品包装：

Rhinogen^® PNGase F（Glycerol-free）包装规格如下：

储存体系：

QPF-001储存在缓冲液中，以液体的形式提供。缓冲液的组成为：50 mM NaCl，20 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25°C)，5 mM EDTA ，本品不含甘油，与下游HPLC、MS分析兼容。

配套试剂：

产品来源：

Rhinogen^® PNGase F（Glycerol-free）是一种将PNGase F基因重组到pET28aT7启动子下游，并在大肠杆菌BL21中进行表达后分离得到的重组糖苷酶，其分子量大小为36KDa。

产品质量：

SDS-PAGE分析，纯度≥95%；没有检测到污染的外切糖苷酶、糖苷内切酶及蛋白酶活性。

产品特性：

最适反应pH：7.5；热失活条件：75°C处理10 min。

酶活定义：

1个酶活力单位定义：在10μl反应体系中，37°C，pH7.5条件下，1小时内催化释放10μg变性RNase B＞95%N-连寡糖所需要的酶量。

1U Rhinogen^® PNGase F=1 unit NEB PNGase F。不同公司产品的酶活力单位换算，请参考活力单位转换表，如下： 

保藏条件：

采用冰袋运输，收到产品后请立即将酶置于2-8℃，严禁冻存；配套试剂置于-20℃储存。本品不含防腐剂，务必确保无菌操作取用，避免污染。

特性： 

Rhinogen^® PNGase F (Glycerol-free)是一种高度纯化和非常稳定的内切糖苷酶，具有稳定性高、比活性高等特点。适用于蛋白质组学及糖生物学研究中糖蛋白上N-连寡糖链的有效释放。

1.高纯度：没有污染蛋白酶/其它糖苷酶，纯度≥95％；

2.高稳定性：每批产品都经过严格的质量控制，以实现产品批间稳定性；

3.高比活性：有效和完全的释放N-连聚糖；

4.与下游HPLC、质谱兼容：不含甘油，酶切体系与HPLC 及质谱工作流程环境兼容。

应用：

1. 从糖肽及糖蛋白上释放完整的N-连聚糖；

2. 表征蛋白质是否糖基化；

3. 用于分子量检测或晶体学研究时去糖基化蛋白质的制备；

4. N-糖基化糖蛋白的结构-功能研究；

5. 糖基化位点的确定。

Q1：PNGase F 去糖基化后得到什么产物？

A1：利用Rhinogen^® PNGase F(Glycerol-free)进行糖蛋白去糖基化后，会释放出完整的寡糖链，并在释放糖链的同时将氨基酸特征序列上的天冬酰胺残基转化为天冬氨酸残基。

Q2：为什么蛋白被降解了？是否可以在PNGase F 去糖基化反应体系中加入蛋白酶抑制剂？

A2：蛋白酶会干扰去糖基化实验的结果，当蛋白质处于变性状态时，它更容易被蛋白酶切割。下列蛋白酶抑制剂中的任何一种均可用于 Rhinogen^® PNGase F(Glycerol-free)去糖基化反应体系中： 抑肽酶 （终浓度10μg/ml） 苄脒（终浓度1mM） 胃蛋白酶抑制剂（终浓度10μg/ml） 亮肽素（终浓度1μM） EGTA（终浓度1mM） EDTA（终浓度1mM） 各种蛋白酶抑制剂建议配制成1000×的浓缩母液，胃蛋白酶抑制剂溶解在甲醇溶液中，其余抑制剂均溶解在水中。

Q3：PNGase F 在含有尿素的反应体系中是否可以正常使用?

A3:有文献报道，PNGase F在37℃条件下，在2.5M尿素溶液中可以稳定24hr，在 5M尿素溶液中可以保留40％的活性。因此反应体系中存在较低浓度的尿素可能不影响Rhinogen^® PNGase F(Glycerol-free)去糖基化的活性。

Q4：对于天然糖蛋白，我应该用多少Rhinogen^® PNGase F(Glycerol-free) 去除糖蛋白上的寡糖链？

A4:当糖蛋白不用 SDS 变性时，由于空间位阻效应（二级和三级蛋白质结构）， Rhinogen^® PNGase F(Glycerol-free)相对很难到达寡糖链的切割位点。有时更多的酶及更长的反应时间有助于提高酶去除寡糖链的效率，但每种糖蛋白都有其特异性，必须根据实验或者经验确定。

Q5：Rhinogen^® PNGase F(Glycerol-free)可以与下游分析如HPLC和质谱兼容吗？

A5:Rhinogen^® PNGase F 有两款产品，PNGase F (Glycerol-free)（QPF-001）及 PNGase F（QPF-002）。两款产品具有相同的活性，特异性及浓度。两者之间的唯一区别是，QPF-002存储在 50％甘油中，而QPF-001在其储存缓冲液中不含甘油。由于甘油以及糖蛋白变性缓冲液（含SDS和DTT）与HPLC和/或质谱不能兼容， 且难以从反应体系中除去，因此如果使用HPLC或质谱进行寡糖链或蛋白分析， 建议使用无甘油的酶即 QPF-001，同时在非变性条件下进行去糖基化反应。非变性条件下通常需要更多的酶及更长的反应时间，推荐使用瑞安相关产品 Rhinogen^® PNGase F (non-reducing format) （ QPF-003 ） ，详情请咨询 techserv@rhinobio.com 。