药物的质量控制包括生产过程以及终产品的质量控制。重组蛋白药物因其特殊的结构通常需要哺乳动物表达体系制备，但由于其来源和生产工艺的特殊性，安全性需要额外关注。利用哺乳动物生产药物的过程包括工程细胞的构建及传代扩增、细胞培养、抗体纯化和制剂。重组抗体药物生产的质量控制包括生产细胞的质量控制和产品的质量控制。

其中，细胞的质量控制主要包括以下几个方面：细胞鉴别、细菌和真菌检测检查、分支杆菌检查、支原体检查、外源因子和内源因子的检查、成瘤性/致瘤性检查等。细胞库是整个生产过程的原材料，监管部门要求进行全面的检测。下图为主细胞库（MCB）的鉴定和检测要求。

关于细胞库检定相应的法规如下

必须证明用于生物制品生产的细胞基质不含外源因子，包括支原体。支原体污染检测必须在产品开发的各个阶段进行，包括原材料、细胞库（MCB+WCB+EOPC）、病毒种子库、未加工的收获液和最终产品。

美国药典＜USP＞63中指出需要用两种方法检测支原体污染：（A）琼脂－肉汤培养法（B）指示细胞法。并提到经验证的核酸扩增方法（NAT）或酶学方法可以用于检测支原体，但前提是该方法经验证可与培养法和指示细胞法等效。

欧洲药典EP2.6.7中也要求培养法和指示细胞法同时检测，并且更详细地介绍了NAT方法代替前1或2种方法的具体验证要求。直接NAT法可以在有细胞毒性的材料中应用或需要快速方法时使用。细胞培养富集后NAT方法适合于待检样品与指示细胞共培养一段时间后，从细胞和上清中提取核酸，再通过NAT检测。

中国药典3301指出主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体；必要时，亦可采用指示细胞培养法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。

培养法

传统的支原体检测采用培养法，是将待测样品接种到合适的液体培养基繁殖，然后再接种到固体培养基中，培养一个月后观察固体培养基中是否有“油煎蛋”菌落出现，如若有则证明该待测样品被支原体污染。培养法是中国药典收录的方法，采用此方法可获得比较可靠的数据。但培养法耗时长，且无法检测到猪鼻支原体。

荧光染色法

荧光染色法是将样品接种到专门的指示细胞中，培养一段时间后利用DNA荧光染料（例如Hoechst 33258）进行染色，正常细胞核区见边缘整齐清晰的荧光，胞质区无荧光。支原体污染的细胞不仅在细胞核而且在细胞核外及细胞膜上均可见散在荧光。此方法同样被中国药典收录，但是方法灵敏度低，重复性差，需要专门的指示细胞。

PCR法

PCR法则是通过设计相应的引物，利用PCR仪扩增对应支原体的核酸序列，也可以在常规PCR基础上加入荧光探针或相应的荧光染料来实现实时定量。此方法可实现快速检测，通常只需要3小时，但是细胞培养液中的物质会对PCR的扩增过程产生影响

酶活法

酶活法是通过检测支原体特异性ATP合成相关酶的活性间接反映支原体的含量，此方法的优势：

1）支原体识别率高，100多种支原体，只有1种不能识别，而这种支原体几乎不会出现在体外的细胞中；

2）可以判断出细胞的状态；

3）不会造成假阳性或者假阴性；

4）检测周期短；

劣势：样品基质中的物质可能会影响ATP酶活性，从而影响检测结果。

自从首次在细胞培养物中发现支原体污染以来，各国监管部门始终关注这一影响生物制品安全性的因素。各国药典或指南中详细描述了几种支原体的检测方法，但是随着生物制药行业的快速发展和经典方法的不足，一些新颖的方法也被作为替代或者补充方法广泛使用。不同的方法灵敏度参差不齐，当该方法用于质量放行时应被充分的验证。

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参考文献